將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21μL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)） 將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM、CY5， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：

5. 結果分析判定

5.1 結果分析條件設定 設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖 像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結果。

5.2 結果判斷 FAM 通道為豬藍耳病毒經(jīng)典型檢測結果，CY5 通道為豬藍耳病毒 NADC30 株檢測結果 陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6. 質(zhì)控標準 陰性質(zhì)控品：Ct 值>38 或無 Ct 值； 陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7. 檢測方法的局限性 1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果；

7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心； 

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。