產(chǎn)品名稱：諾如病毒G1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

Name：Norwalk Virus G1(NV-1) RT-PCR Kit

包裝規(guī)格：50T/盒。

諾如病毒（Norwalk Virus）是單股正鏈 RNA 病毒，屬于人類杯狀病毒屬，是一種引起非細(xì)菌性急性腸胃炎的病毒，如諾病毒感染性強(qiáng)，以腸道傳播為主， 通過口-糞傳播，以污染的水源、食物、貝類、物品、空氣作為主要傳播載體。諾如病毒可分為 G I-G 五個(gè)基因群，其中引起人類感染的主要是 G1 和 G2 群。因此快速靈敏診斷具有重要意義。本產(chǎn)品以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)諾如病毒 G1 型的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)諾如病毒 G1 型高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒的RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。

6.本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分

諾如病毒G1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。

自備試劑樣品：RNA

使用方法

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)

性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL 陽(yáng)性對(duì)照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣， 以此作為PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的柱式病毒 RNAout。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好

后最后加）：

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 qRT-PCR：

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽(yáng)性。