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產(chǎn)品簡介
剛地弓形蟲探針法熒光定量PCR試劑盒剛地弓形蟲（Toxophasma gondii）簡稱弓形蟲，弓漿蟲。寄生于人和許多種動物的有核細胞，引起人畜共患的弓形蟲病。特別是在宿主免疫功能低下時致病，屬機會致病原蟲。
產(chǎn)品分類
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剛地弓形蟲探針法熒光定量PCR試劑盒
產(chǎn)品名稱：剛地弓形蟲探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：Toxophasma gondiI Probe qPCR Kit
剛地弓形蟲（Toxophasma gondii）簡稱弓形蟲，弓漿蟲。寄生于人和許多種動物的有核細胞，引起人畜共患的弓形蟲病。特別是在宿主免疫功能低下時致病，屬機會致病原蟲。因此快速靈敏檢測剛地弓形蟲有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)剛地弓形蟲高度保守區(qū)設計，不會跟其他微生物 DNA 發(fā)生交叉反應。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
【試劑組成】
成分 | 包裝 |
2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL（本色蓋） |
熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
剛地弓形蟲探針法 qPCR 引物 混合液 | 100 μL（白蓋） |
剛地弓形蟲 qPCR 探針 | 100 μL（棕色管） |
剛地弓形蟲探針法 qPCR 陽性 對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL（黃蓋） |
| 核酸釋放劑（試用裝） | 20 次（1mL，綠蓋） |
【儲存條件及有效期】
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】DNA 模板
【使用方法】
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭， 下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA/提取試劑盒兼容。本試劑盒免費贈送 20 次免 DNA 提取的核酸釋放劑，本產(chǎn)品的裂解液可以直接作為 PCR 模板，省略了 DNA 提取步驟。其使用手冊可向本公司客服索取。
三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設 置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分 | 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性 對照管 | 標準曲線樣品管（2-7 管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
剛地弓形蟲 qPCR 探針 | 1 μL | 1 μL | 各 2 μL |
剛地弓形蟲探針法 qPCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
N+2 個待測 DNA 模板 | 6 μL | - | - |
超純水 | - | 6 μL | - |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7 號） | - | - | 各 6μL（2 號樣到 2 號管，3 號 樣到 3 號管…） |
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 95℃ | 5 min |
PCR 反應 （40 個循環(huán)） | 95℃ | 15sec |
60℃ | 60sec（采集 FAM 通道的熒光 信號） |
四、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
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