人免疫缺陷病毒I型通用探針法RT-PCR試劑盒

產(chǎn)品名稱：人免疫缺陷病毒I型通用探針法RT-PCR試劑盒

英文名稱：Human Immunodeficiency Virus 1(HIV-1) RT-PCR Kit

人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus;abbr:HIV），即艾滋?。ˋIDS，獲得性免疫缺陷綜合征）病毒，是造成人類免疫系統(tǒng)缺陷的一種病毒。1981年，人類免疫缺陷病毒在美國首ci發(fā)現(xiàn)。它是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒，屬逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。目前全球流行的主要是 HIV-1。本產(chǎn) 品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測人免疫缺陷病毒 I 型通用的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.       即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。

2.      引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高。

3.      提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.      特異性高，引物是根據(jù)人免疫缺陷病毒I型RNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，可以檢測人免疫缺陷病毒I型，不會跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.      既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。

6.      本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量RT-PCR反應(yīng)。

7.      本產(chǎn)品只能用于科研。

【試劑組成】

【自備試劑】超純水，樣品RNA。

【注意事項(xiàng)】

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1.      標(biāo)記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。

2.      用帶芯槍頭分別加入45μL熒光RT-PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.      在6號管中加入5μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.      換槍頭，在5號管中加入5μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.      換槍頭，在4號管中加入5μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.      重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品RNA的制備

7.       如果有N個樣品，最好設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8.      用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)RNA/提取試劑盒兼容。

三、Probe qRT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.      如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.       在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

11.      蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR：

五、數(shù)據(jù)處理

12.       如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。

13.      如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于45。陽性對照必須有熒

光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于40。對待測樣品，如果其Ct大于或等于45則為陰性，如果小于或等于40則為陽性。如果在40-45之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于45則為陰性，如果小于40，則為陽性。